· poliacrilamidăGelul trebuie format din monomer de acrilamidă, material de pornire pentru polimerizare, catalizator și amestecul de sare și tampon.
· acrilamidăiar BIS (N,N'-metilen dublă acrilamidă) este matricea de gel sub formă de monomer.
· persulfatul de amoniu inițiază procesul de polimerizare a adezivului. Formularea adezivului necesită o soluție de persulfat de amoniu 10% preparată în apă. Majoritatea informațiilor au indicat necesitatea utilizării active. Cu toate acestea, soluția de 10% poate fi plasată la 4℃ timp de câteva săptămâni fără o pierdere semnificativă a activității. Se completează până la 10 ml și se aruncă când adezivul nu se mai agregă.
Sfat: Procentul deacrilamidăÎn secvențiere, lipiciul și lipiciul proteic nu sunt la fel. Dacă utilizați o soluție prefabricată de acrilamidă: BIS, asigurați-vă că alegeți sticla potrivită.
· TEMED (N, N, N', N'-tetrametil etilendiamină) este un catalizator, într-o sticlă maro, pusă la frigider. Se adaugă chiar înainte de turnarea lipiciului.
· Sticla utilizată în electroforeză cu poliacrilamidă trebuie spălată înainte și după fiecare utilizare. După electroforeză, se spală cu o perie moale și o cârpă în apă fierbinte cu săpun, se clătește cu apă distilată și se lasă să se usuce.
· Umiditatea și praful pot fi cauzate de polimerii tubulari. Înainte de electroforeză, curățați placa de sticlă cu un detergent de sticlă și ștergeți-o cu o perie moale. Spălați cu apă distilată și uscați bine cu un șervețel de hârtie. Clătirea cu etanol 70% înainte de ștergerea cu hârtie ajută la curățare și la accelerarea uscării. Adăugați succesiv probe de acrilamidă: BIS, apă, soluție tampon, persulfat de amoniu, TEMED. Agitați bine și turnați imediat.
Nu este necesară degazarea poliacrilamidei înainte de polimerizare. (Acrilamida era plasată în vid pentru a elimina bulele, deoarece oxigenul inhibă polimerizarea.)
Vârfuri de mostre cu punct de lipire orizontal.
· puneți o bucată de hârtie neagră în cutia de jos, cu fundal negru, pentru a face o gaură în probă și a vedea mai clar.
· rezervor de adeziv umplut cu soluție tampon, puțin peste coloid.
· dacă marginea este luminoasă, aprindeți luminile, lăsați lumina coloidală să strălucească. Extrageți proba în pipetă.
· utilizarea unui dispozitiv automat de pipetare.
· la 10-200 mu, 1 punct de mișcare a lichidului poate fi utilizat în majoritatea punctelor de pe probă. Pentru găuri foarte mici ale probei (mai puțin de 10 μ1), capul lung de pipetă utilizat pentru secvențierea adezivului este mai convenabil.
· pipetarea se face doar cufundarea în probă, inhalând fluid care se mișcă lent. Proba poate părea lipicioasă din cauza glicerinei, iar pomparea rapidă poate atrage bule de aer în capul pipetei.
· După inhalarea probelor, capul de pipetare va mișca ușor capul de lichid pe marginea țevii sau va aspira lichidul în afara picăturilor prin ștergerea hârtiei. Aveți grijă să nu aspirați proba.
Plasați proba în orificiul pentru probă
· dispozitiv de pipetare pentru a menține o presiune redusă, face ca probele să se miște ușor în capul de preaplin al lichidului.
· capul de pipetare introdus în tampon, puțin mai sus decât orificiile punctuale, menține o presiune pozitivă. Vârful pipetei poate fi introdus într-un orificiu mic.
· Scoateți probele încet și constant. Vârful pipetei este plasat deasupra orificiului pentru probă, iar proba se va scufunda în orificiu. Lăsați proba să se scufunde pentru a umple orificiul, în loc să o împingeți înăuntru.
· odată cu ultima picătură de probă cu lichid, lichidul se va deplasa la al doilea picior, ridicați încet lichidul și ieșiți din tampon
Cum se face eșantionarea verticală a adezivului?
· puncte de lipire verticale, găuri de probă formate între două bucăți de sticlă. În cazul unui lipici foarte subțire, capul pipetei nici măcar nu poate fi introdus între două plăci de sticlă. Atenție la glicerină! Puneți capul pipetei peste orificiul pentru probă, iar proba se va scufunda în orificiu.
· Înainte de a preleva proba, asigurați-vă că punctul vertical al orificiului pentru proba de gel acil din polipropilenă este clătit și curat. Spălați acrilamida nepolimerizată și apa care poate apărea în partea de jos a orificiului pentru proba. Apa poate micșora semnificativ orificiul pentru proba. Folosiți o seringă de 25 ml sau 50 ml și un ac de calibru 18. Turnați soluția tampon de electroforeză și clătiți cu grijă orificiul pentru proba.
· poate fi dificil să se vadă orificiul din probă, dar în rest totul este ușor. Dacă există orificii în exces, soluția tampon pentru probă poate fi testată cu albastru de bromofenol.
Data publicării: 31 martie 2023