· poliacrilamidămust de gel prin monomer de acrilamidă, materie primă de polimerizare, catalizator și dreptul de amestec de sare și tampon împreună.
· acrilamidăși BIS (N,N'-metilen dublă acrilamidă) este matricea de gel sub formă de monomer.
· persulfat de amoniu începe procesul de polimerizare adeziv.Formularea adezivului necesită o soluție de persulfat de amoniu 10% preparată în apă.Majoritatea informațiilor au indicat necesitatea utilizării active.Cu toate acestea, soluția de 10% poate fi plasată la 4℃ timp de câteva săptămâni fără pierderi semnificative de activitate.Completați până la 10 ml și aruncați-l atunci când adezivul nu se adună.
Sfat: procentul deacrilamidăîn secvențierea lipici și lipici proteic nu este același lucru.Dacă utilizați soluție prefabricată de acrilamidă: BIS, asigurați-vă că obțineți sticla potrivită.
· TEMED (N, N, N', N '- tetrametil etilendiamina) este un catalizator, intr-o sticla maro, introdus la frigider.Adăugați chiar înainte de a turna lipici.
· electroforeza poliacrilamidă sticla folosită în electroforeză trebuie spălată înainte și după fiecare dată.După electroforeză, se spală cu o perie moale și o cârpă în apă fierbinte cu săpun, se clătește cu apă distilată și se lasă să se usuce.
· umiditatea și praful pot cauza polimerul gol.Înainte de electroforeză, curățați placa de sticlă cu detergent de sticlă și ștergeți-o cu o perie moale.Se spală cu apă distilată și se usucă bine cu un șervețel de hârtie.Clătirea cu 70% etanol înainte de ștergerea cu hârtie ajută la curățarea și la accelerarea uscării.Adăugați succesiv mostre de acrilamidă: BIS, apă, soluție tampon, persulfat de amoniu, TEMED.Agitați bine și turnați imediat.
Nu este necesară degazarea poliacrilamidei înainte de polimerizare.(Acrilamida obișnuia să fie plasată în vid pentru a îndepărta bulele, deoarece oxigenul inhibă polimerizarea.)
Vârfuri de probă de punct de lipire orizontal.
· puneți o bucată de hârtie neagră în caseta de jos, fundal negru pentru a face o gaură de probă pentru a vedea mai clar.
· rezervor de lipici umplut tampon, chiar peste coloid.
· dacă marginea are lumină, aprindeți luminile, lăsați lumina să strălucească coloid.Atrageți proba în pipetă.
· utilizarea dispozitivului automat de pipetare.
· în 10-200 mu 1 punct de mișcare lichid poate fi utilizat în majoritatea punctelor de pe eșantion.Pentru găurile de probă foarte mici (mai puțin de 10μ1), capul lung al pipetei folosit pentru secvențierea lipiciului este mai convenabil.
· pipetarea tocmai scufundată în probă, inhalând fluid care se mișcă încet.Proba poate părea lipicioasă cu glicerină, iar pomparea rapidă poate atrage bule de aer în capul pipetei.
· probele după inhalarea capului de pipetare, vor mișca ușor capul de fluid pe marginea țevii sau hârtia de ștergere va aspira capul de lichid în afara picăturilor.Aveți grijă să nu sugeți proba.
Puneți proba în orificiul pentru eșantion
· Dispozitiv de pipetare pentru a menține puțină presiune, face ca probele să se miște ușor capul lichid de preaplin.
· capul de pipetare introdus în tampon, puțin mai sus decât găurile spot, menține presiunea pozitivă.Vârful pipetei poate fi introdus într-o gaură mică.
· lent și constant probele.Vârful pipetei este plasat deasupra orificiului punctului de probă, iar proba se va scufunda în orificiu.Lăsați proba să se scufunde pentru a umple gaura de eșantion în loc să împingeți.
· odată cu ultima picătură de probă cu cap de lichid, lichidul se va muta în al doilea picior, ridicați încet mișcarea lichidului, ieșiți din tampon
Cum se face eșantionarea verticală a lipiciului?
· găuri verticale de probă formate între două bucăți de sticlă.În adeziv foarte subțire, capul pipetei nici măcar nu poate fi introdus între două plăci de sticlă.Ai grijă la glicerina!Puneți capul pipetei peste orificiul pentru probă și proba se va scufunda în orificiu.
· punctul de probă înainte, asigurați-vă că puneți punctul vertical al orificiului de probă de polipropilenă acil gel este clătit curat.Spălați acrilamida nepolimerizată și apa care poate apărea în partea de jos a găurii de probă.Apa poate face orificiul probei semnificativ mai mic.Utilizați o seringă de 25 ml sau 50 ml și un ac de calibrul 18.Se toarnă tamponul de electroforeză și se spală cu atenție orificiul de probă.
· poate fi dificil să vezi gaura probei, dar, în același timp, restul este ușor.Dacă există găuri în exces, tamponul de probă poate fi testat cu albastru de bromofenol.
Ora postării: 31-mar-2023